Um kit de montagem de DNA para desbloquear o CRISPR

Recurso de 30 de agosto de 2023

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por Thamarasee Jeewandara, Phys.org

As repetições curtas de palíndromo agrupadas regularmente interespaçadas (CRISPR) e a proteína 9 associada a Crispr (CRISPR/Cas9) são agora um método revolucionário e bem conhecido para projetar células microbianas.

Uma vantagem importante do CRISPR permanece no desenho da cepa para facilitar a integração cromossômica para permitir a montagem de DNA livre de marcadores. Esses sistemas de edição são altamente benéficos; entretanto, sua montagem não é tão simples e pode impedir seu uso e aplicações.

Num novo relatório publicado na Nature Communications Biology, Tigran V. Yuzbashev e uma equipa de investigação identificaram os limites dos kits de ferramentas Cas9 existentes concebidos para tornar as técnicas CRISPR mais fáceis de aceder e implementar. Eles discutiram três métodos diferentes e bem estabelecidos e os combinaram para formar um kit de ferramentas abrangente para engenharia metabólica eficiente usando CRISPR/Cas9.

Um único kit de ferramentas composto por 147 plasmídeos para gerar e caracterizar uma biblioteca de 137 promotores para construir um ácido homogentísico em laboratório.

O sistema CRISPR/Cas9 pode realizar modificações genômicas rápidas, precisas e sem cicatrizes para fornecer um escopo significativo para projetar cepas microbianas para bioprodução. A engenharia metabólica de leveduras, por exemplo, fornece uma área de rápido crescimento na biologia da engenharia para a produção sustentada de produtos químicos, combustíveis, alimentos e produtos farmacêuticos.

As leveduras têm um potencial metabólico semelhante ao das células eucarióticas e, portanto, são mais fáceis de projetar e cultivar em grande escala. Como resultado, os bioengenheiros projetaram e desenvolveram sistemas CRISPR para leveduras.

Devido à sua alta eficiência, o CRISPR permite modificações genômicas sem marcadores. Neste trabalho, Yuzbashev garantiu a otimização de cepas e facilitou projetos de engenharia metabólica, identificando três melhorias do sistema CRISPR/Cas9 para engenharia de leveduras. Os métodos incluíram: 1) a troca fácil entre modificações com marcadores e sem marcadores, 2) a troca rápida de braços de homologia para determinar diferentes locais de integração e 3) um método fácil para clonar gRNAs.

Para permitir a integração sem marcadores baseada em CRISPR, a equipe escolheu uma quebra de fita dupla induzida por Cas9, que teve que ser reparada para conseguir a proliferação celular. Os cientistas tornaram isso possível usando um modelo ou doador, integrado por meio de recombinação homóloga ou junção final não homóloga (NHEJ) – sem integração. O processo de união final não homóloga é observado na maioria das espécies de fungos, incluindo a levedura de padeiro Saccharomyces cerevisiae.

Em espécies com mecanismo NHEJ predominante, a equipe melhorou a recombinação homóloga excluindo os genes NHEJ. Se um método sem marcadores não tiver sucesso, os cientistas pretendem subsequentemente melhorar a integração assistida por CRISPR-Cas9 para reverter facilmente para a integração baseada em marcadores.

A integração assistida por Cas9 normalmente requer um modelo doador que consiste em um cassete integrado flanqueado por dois braços de homologia. A equipe teorizou que a integração ideal do CRISPR/Cas9 deveria trocar armas de homologia em construções de doadores Cas9 pré-avaliadas por meio de uma reação de montagem Golden Gate simplificada.

Além disso, os promotores são um elemento chave para qualquer projeto de engenharia metabólica para redirecionar o fluxo para os produtos de interesse. Yuzbashev et al. usaram a levedura industrial Yarrowia lipolytica para desenvolver um kit de ferramentas de engenharia metabólica que combinava estratégias de edição de genes e montagem de DNA para alta eficiência e versatilidade.